Multibeammicroscoop brengt 3d-beeldvorming cellen in stroomversnelling

Het maken van een gedetailleerd, driedimensionaal beeld van cellen of weefsels is zeer interessant voor onderzoek in biowetenschappelijke domeinen zoals de celbiologie en medische weefselbiologie. Dit geeft onderzoekers naast een overzicht van het weefsel ook nauwkeurige informatie op nanometerschaal. Voor het maken van dergelijke 3d beelden moet je zeer dunne plakjes van de celstructuren of weefsels maken. Deze plakjes moeten worden gescand om vervolgens een 3d-reconstructie mee op te bouwen.

Dit proces vereist een apparaat dat in staat is om elk plakje afzonderlijk en in detail te scannen. Tot nu toe vormde dit het probleem. Een ‘normale’ lichtmicroscoop kan direct een foto van het monster maken. Door de maximale resolutie van ongeveer 400 nm van zo’n microscoop zijn de beelden echter niet gedetailleerd genoeg. Met een resolutie van ongeveer 1 nm biedt een traditionele scanning electron microscope (sem) wel voldoende detail. Met de sem moet je echter alle plakjes pixel voor pixel scannen, wat tijdrovend is en maanden of jaren in beslag zou kunnen nemen.

Gebruikersvriendelijk

Er moet toch een slimmere manier zijn om deze beelden te maken, dacht een groep bedrijven, waaronder Delmic, Technolution en Thermo Fisher. Ze bundelden daarom hun krachten met de TU Delft en richtten een consortium op om een nieuw sem-type te creëren: een multibeam sem. Ze stelden zich ten doel om een innovatief apparaat te bouwen met een hoge resolutie en een sterk verhoogde doorvoersnelheid, om het scanproces te versnellen en de meettijd terug te brengen tot dagen of zelfs uren. Dit zou van de multibeam sem een geschikte hoogvolumetechniek maken voor onderzoek in de levenswetenschappen.

‘We wilden een apparaat ontwikkelen dat honderd keer sneller zou zijn dan de traditionele sem en met een zeer hoge resolutie’, legt Delmic-cto Andries Effting uit. ‘Tegelijkertijd wilden we een gebruikersvriendelijk systeem ontwikkelen dat met minimale gebruikersinput zou kunnen draaien – min of meer zelfstandig werkend. Bovendien wilden we een apparaat ontwikkelen dat we tegen een redelijke prijs op de markt zouden kunnen brengen voor onze klanten.’

Sinds de start van het consortium twee jaar geleden hebben de partners veel vooruitgang geboekt. Samen hebben ze een alfa- en een bètasysteem gebouwd. Deze systemen leverden een proof of principle en vormden de noodzakelijke stappen om te zien of er geen ontwerpfouten zaten in het engineeringgedeelte. Op dit moment werken de partners aan het definitieve ontwerp van de multibeam sem – een snel en gebruikersvriendelijk apparaat met een resolutie van 4 nm – dat eind dit jaar zal worden geïntroduceerd in de markt.

Elk lid van het consortium brengt zijn eigen specialisme in. Aan de TU Delft werken onderzoekers al meer dan tien jaar aan een multibeam sem-techniek. Op dit moment doet een groep promovendi onderzoek om het multibeam systeem gebruiksklaar te maken. Thermo Fisher levert met zijn kennis en ervaring in het bouwen van sems de infrastructuur voor het nieuwe apparaat. Technolution richt zich vooral op de sensoren en de data-acquisitie en -verwerking. Het bedrijf is verantwoordelijk voor de gehele datastroom, van het uitlezen van de gegevens tot de beeldverwerking en de opslag. Delmic zorgt voor de sampledoorvoer, de detectoroptiek en de software-integratie van het systeem en houdt zich bezig met de verkoop van het product aan klanten.

64 crt-tv’s

Een sem produceert beelden van een monster door het oppervlak te scannen met een gefocuseerde elektronenbundel. De elektronen in deze bundel hebben op verschillende manieren interactie met het monster, wat resulteert in drie populaties elektronen die je kunt detecteren. In een traditionele sem meet je twee van deze populaties meestal met detectoren die boven het monster zijn gemonteerd. Dit zijn de secundaire elektronen, die informatie geven over de eigenschappen van het oppervlak, en de teruggekaatste elektronen, die informatie geven over de samenstelling van het materiaal.

De derde populatie elektronen kun je detecteren in een opstelling die bekendstaat als een scanning transmission electron microscope (stem). In zo’n apparaat identificeert een detector onder het monster de elektronen die erdoorheen gaan. Deze transmissie-elektronen bieden waardevolle informatie voor de beeldvorming van biologische monsters, omdat ze de visualisatie van lokale dichtheidverschillen in het monster mogelijk maken.

Een stem detecteert zowel de hoeveelheid als de energie van de elektronen die door het monster gaan en geeft zo informatie over de lokale dichtheid. Het aantal elektronen dat erdoorheen gaat, is afhankelijk van de structuur van het monster. Hoe dichter het materiaal, hoe meer het de elektronen verstrooit, waardoor deze de detector niet zullen bereiken. Dit resulteert in een lagere intensiteit van de gedetecteerde elektronenbundel. Door het monster pixel voor pixel te scannen, ontstaat een beeld dat de lokale dichtheidsverschillen van de weefselstructuren laat zien. Omdat biowetenschappelijke onderzoekers vooral geïnteresseerd zijn in de beeldvorming van celmembranen van weefsels, kleuren ze deze celmembranen om het contrast in hun monsters te versterken.

Marc van Eert, een toegepast wetenschapper bij Technolution, legt uit: ‘Normaal gesproken gebruikt een sem slechts één elektronenbundel. Wij hebben een systeem ontwikkeld met meerdere bundels, waarmee we verschillende delen van het monster tegelijkertijd kunnen scannen. Dit is mogelijk, omdat je in de transmissiemodus de secundaire elektronenbundels afzonderlijk kunt meten. Ons apparaat is ontworpen met een raster van acht bij acht bundels, dus vierenzestig in totaal. Dit versnelt het proces enorm. Je kunt ons systeem vergelijken met vierenzestig crt-tv-schermen die tegelijkertijd hun beelden schrijven en elk een deel van het grotere plaatje laten zien. In ons geval schrijven we echter geen beeld, maar lezen we een monster met vierenzestig elektronenbundels tegelijk. Elke bundel scant een ander deel van het monster – een gebied van 3,2 µm bij 3,2 µm. Vervolgens combineren we de informatie van alle afzonderlijke bundels om er één beeld uit samen te stellen.’

Overspraak

Hoewel dit vrij eenvoudig klinkt, waren er veel technische uitdagingen bij het ontwerp van dit nieuwe apparaat. ‘We konden dit systeem niet op een evolutionaire manier realiseren – door stapsgewijze veranderingen door te voeren – omdat we alle onderdelen van het systeem tegelijkertijd moesten aanpassen om er een multibeammachine van te maken’, vertelt Van Eert. ‘Dit zou niet mogelijk zijn geweest zonder gebruik te maken van systeemengineering. In feite hebben we het bestaande sem-systeem volledig herschikt en omgevormd naar een nieuw werkingsprincipe. We hebben er dus op een meer revolutionaire manier aan gewerkt. Als gevolg daarvan zijn we er ook in geslaagd om een systeem te ontwerpen met een kortere belichtingstijd per pixel. Dit versnelt het proces ook aanzienlijk.’

Het werken met veel elektronenbundels tegelijk brengt twee voor de hand liggende uitdagingen met zich mee: het beperken van overspraak tussen aangrenzende bundels en het vinden van een slimme manier om alle bundels te gebruiken om één beeld samen te stellen dat het hele oppervlak van het monster beslaat. Omdat de elektronenbundels zeer dicht bij elkaar opereren, kan één bundelsignaal invloed hebben op naburige signalen. Van Eert: ‘Dit overspraakeffect moesten we minimaliseren om de juiste informatie uit alle individuele bundels te krijgen. We hebben dit bereikt door de bundeloptiek zeer nauwkeurig af te stemmen op de detector. Tijdens het acquisitieproces wordt de uitlijning continu bewaakt en waar nodig bijgesteld.’

Scans op aanvraag

Voor het samenstellen van één beeld uit de informatie afkomstig van alle vierenzestig elektronenbundels moet elke bundel zijn eigen gebied scannen, inclusief enkele pixels van naburige bundels. Deze overlap is nodig om een compleet beeld te krijgen van alle bundelsignalen en om er zeker van te zijn dat er geen informatie ontbreekt. Door het systeem te kalibreren, is het mogelijk om te bepalen hoe de verschillende beelden moeten worden samengesteld om er één beeld van te maken.

‘In feite is het hele concept veranderd ten opzichte van een traditionele sem’, verduidelijkt Van Eert. ‘Omdat het scannen met een traditionele sem nogal tijdrovend is, moet de onderzoeker het apparaat zelf bedienen om zorgvuldig het deel van het monster te selecteren waarin hij geïnteresseerd is. Omdat de multibeam sem het mogelijk maakt om een groot gebied zelfstandig en in een redelijke hoeveelheid tijd te scannen, is het mogelijk om het hele monster in één keer te doen en later een kleinere selectie van dit gebied te maken. De bediening van de multibeam sem kan worden gedaan door een technische operator, die alleen het scannen van de monsters faciliteert en vervolgens de data met beeldgegevens aflevert aan de specialist. Deze manier van werken opent zelfs de deur naar het realiseren van scancentra, die – net als kopieercentra die kopieën aan hun klanten leveren – scans op aanvraag uitvoeren.’

Een andere uitdaging is de enorme hoeveelheid gegevens die het systeem produceert, voegt Effting toe. ‘We hebben een routekaart gemaakt naar een data-acquisitiesnelheid van één gigabyte per seconde, wat betekent dat er elke twee uur een volledige harde schijf nodig is. Stel je voor dat je het systeem een paar weken lang vierentwintig uur per dag en zeven dagen per week laat draaien. Dit zal een enorme hoeveelheid gegevens opleveren. Bovendien moet je al deze data verwerken. Als we dit allemaal onder controle hebben, dan moeten we er ook nog voor zorgen dat de onderzoekers die de monsters voorbereiden de machine kunnen bijhouden.’